0507乳酸菌抑制 E. coli K12 實驗

　　之前活化的菌種要做抑制測試了！活化菌種請看「0429活化菌種」。而 5/1 學妹有將 MRS 中的菌種接種到 m-MLB 培養基上，每盤接 4 菌種。

　　接種裝置如照片，將培養基放在中間，吸取 15 μL 的菌液，將 tips 拔起，放在上方黑圈內，再將上方那層往下壓，到碰觸培養基即可。

　　在無菌台放過夜（23℃），然後在 25℃ 培養。今日測試與 E. coli 的抑制反應。

編號：左1、下2、右3、上4

水浴槽

準備動作：

* 無菌操作台開啟 UV 15min

* 依老師配方配置好 m-MLB，滅菌，用分注器，每盤 25mL

* 滅菌過之 1000μL、200μL需要的 tips

* 配置 TSA 的「soft agar」。即為原 agar 濃度的一半（0.75%），放置螺旋管備用，今天才放入加熱器加熱，並放置水浴槽保溫在 45℃。（水浴槽的水要淹過內容物）

先用這個加熱

需要物品：

1、震盪器

2、垃圾桶

3、50mL 離心管放小燒杯

4、tips

5、E. coli

◎ 預備動作，先將 E. coli 稀釋：

因原菌液菌數很多，故用離心管先裝 20mL 左右的 TSB，再加入 1mL 的菌液。放小燒杯備用。（使用 TSB 是因為沒有準備好 0.85% 的生理食鹽水，故拿現有的。不然老師說，一般不必使用這麼好的。）

 實驗步驟：

1、從水浴槽拿 3 管 TSA，擦乾外圍水滴後拿入無菌操作台（放 10*5 的試管架，因 5*5 的容易倒掉）

2、吸取菌液 100μL 

3、沿著 TSA 的螺旋管管壁注入（避免較低溫的菌液直接接觸 TSA ）

4、注入 3 管後，將 tip 吐掉

5、鎖緊後使用震盪器使混勻

6、接著緩慢倒入有接種乳酸菌的 m-MLB 培養基中（螺旋管靠近開口有一凹陷處，使用此地方攔截泡沫，避免倒入培養基中）

7、倒完三盤後，堆至後方，打開上蓋使風乾。等下批倒好即可收。

8、倒完全部後，放入培養箱 35℃ 培養 24hr 後再觀察抑菌圈

* m-MLB（pH 4.96）是經過江老師更改配方，使更適合 E. coli 生長的培養基。（去除原配方的蘋果酸）

* E. coli K12 使用要小心，它是無毒性的大腸桿菌，故不用戴手套，若滴落，用紙巾噴濕酒精後擦掉即可。

清洗螺旋管：
用大盆裝試管架，螺旋管倒扣放入，水裝一半（如我手指處），進去滅菌。
因底部還有凝結的 TSA 故這樣會使熱水充滿螺旋管，才能洗淨。

* 相關文件：接菌方式請見「20140501 抑菌活性測試」（共筆夥伴才可觀看）